脉冲电场消融后局部注射氯化钙可提高心脏电穿孔的急性疗效
众所周知，不可逆电穿孔技术的原理是：通过极短且高强度的电场使得细胞膜上产生永久性纳米孔隙，破坏细胞内外渗透压平衡，从而使细胞死亡。脉冲场消融（PFA）已成为治疗心律失常的一种创新疗法，怎么在保障安全性的前提下提高长期的有效性是临床目前最为关心的话题。
与PFA在肿瘤中的应用相似，氯化钙（CaCl2）作为一种辅助疗法（称为钙电穿孔）可能会放大PFA的凋亡效应。心房中的PFA可增强钙通过PFA产生的孔隙的内流，从而利用PFA的渗透作用，即使在功率较低的情况下也能提高消融效果。
近期发表的一篇文献表明PFA消融后局部注入氯化钙可显著提高电穿孔在猪心房中的即时疗效。这项研究表明，钙电穿孔可以在不增加能量的情况下提高PFA的疗效，从而降低相关风险。这些初步研究结果值得进一步研究钙电穿孔在PFA中的长期疗效和潜在临床应用。
1.1实验模型
我们的研究利用梅奥诊所动物护理和使用机构委员会 (IACUC) 批准的动物模型，评估了PFA后钙灌注对病变发展的影响。
1.2动物模型和研究方案
选择了七头猪，以评估PFA后钙灌注对病变形成的影响。在股静脉建立血管通路，使用 CARTO3系统（Biosense Webster Inc，Diamond Bar，CA）构建右心房电解剖图。使用低PFA功率（250V，20μs， 50个脉冲，间隔200ms，总消融时间10s）进行消融，分为两组：使用4mm双极灌注消融导管灌注CaCl2的一组（钙组）和生理盐水灌注的一组（对照组）。使用BTX 830电穿孔发生器输送PFA能量(Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA）。PFA 之后，病灶被随机分配为钙剂或生理盐水灌注。病灶之间保持足够的距离，以避免消融病灶重叠。
在钙剂组，PFA结束后10秒内立即通过导管灌洗口注入100mg/ml的CaCl2（共200毫克），然后用生理盐水冲洗。两组的压力均保持在5至15克之间。在CARTO3系统上标记并记录损伤部位，以便术后精确识别。动物至少存活4小时，然后在30ml生理盐水中静脉注射3.0g三苯基氯化四氮唑后处死。手术后切除心脏，分析消融病灶特征。
1.3电压和消融病灶体积测量
电压振幅是通过Mac-Lab(GE HealthCare.)系统中的峰-峰双极电压测量的。在PFA之前和之后测量心电图参数。电压差的计算方法是将消融前的值减去消融后的值。病变体积通过使用数字千分尺分析组织切片获得。测量每个病灶的最大深度和宽度。病灶体积的计算公式如下：
1.4组织学检查
心脏保存在中性缓冲福尔马林中，切片并用苏木精-伊红（HE）染色。由独立的、双盲的病理学家在对HE染色进行评估后，使用评分系统（0=无异常发现；1=轻微至轻度；2=轻度；3=中度；4=重度）确定组织学严重程度评分。
1.5统计学分析
连续变量的描述性统计以平均值±标准误差的形式展示。局部区域的低电压和低电压移行区之间的比较在同一动物的标测图之间进行。P值＜0.05视为具有统计学意义。所有分析均使用Stata MP64第16版（STATA Corp，College Station，TX，USA）进行。
2 结果
在本研究中，我们对7头猪进行了体内消融，对照组和钙灌注组均有19个病灶（表1）。在使用PFA前，对照组和钙离子灌注组的电压振幅相似，对照组为0.93±0.12mV，钙离子组为1.13±0.16mV，p=.32，图1A）。然而，与对照组相比，钙组应用PFA后的电压明显降低（分别为0.32±0.03mV vs. 0.58±0.09mV，p=.017，图1B）。值得注意的是，PFA消融后，对照组的电压没有明显降低，而钙组的电压则大幅降低（分别为0.35±0.11mV vs 0.81±0.17mV，p=.028，表1）。心电图参数中的 delta HR、Post QTc和delta QTc 存在明显差异（表 1）。
图2A显示了对照组和钙组的病理结果。大体病理检查显示，病变的最大表面直径（对照组为 4.6±0.6mm，钙组为8.1±0.6mm，p< .001）、深度（对照组为0.7±0.1mm，钙组为1.2±0.1mm，p＜0.001），消融灶体积（对照组为8.3±2.3mm3 ，钙组为29.0±3.9 mm3，p<.001）（表2和图2）。
从组织学角度看，钙组中的病变往往表现为内皮下中度到重度的急性变化，包括微出血，从而标记出消融灶的部位。这些损伤灶的急性反应是以中性粒细胞、肌溶解和收缩带坏死为特征的。炎症和出血的损伤灶的损伤程度从轻微到严重不等。病变的心肌内还出现细胞核固缩，这反映了DNA损伤和/或细胞凋亡（图3A-C）。相反对照组的病变要么在正常范围内，要么仅表现出轻微的急性病变（图3D、E）。钙组的严重程度评分明显高于对照组（表2）。
3 讨论
这项研究通过在体内模型中进行PFA后CaCl2灌注，初步揭示了辅助治疗对损伤灶的影响。与对照组相比，钙治疗组的损伤灶参数明显增加。这一发现引发了两个关键的讨论：(1) PFA后钙吸收的动态；(2)通过钙电穿孔形成病变的机制。
首先，PFA后的钙吸收至关重要。PFA产生的电场可提高细胞的通透性，从而实现电渗透介导的分子运输。这种转运的性质取决于分子特性和电场强度，PFA的效应根据电场强度可分为可逆效应和不可逆效应。钙的正电荷有利于其在脉冲期间从细胞外向细胞内的电泳移动，以及脉冲后的扩散移动。此外，离电极较远的组织通常总是会被可逆电穿孔，即使以可逆电穿孔为目标，在任何电极附近也会发生部分不可逆电穿孔。
然而，即使是这些可逆损伤，在应用PFA期间和之后也会立即出现短暂的通透性。我们的研究结果表明，这些可逆性损伤对钙的吸收增强，促使其转变为不可逆损伤。组织学数据也证明了这一点，这些数据显示了钙组的急性炎症反应、收缩带坏死以及与微小出血病变相关的肌溶解。这些发现与其他研究中描述的PFA后急性变化相似。在这些研究中，PFA急性病变的特点是在PFA后立即出现小范围的微出血，周围是收缩带坏死和肌溶解。此外，钙组中的病变表现为细胞核固缩，表明DNA损伤和凋亡。因此，我们的结果表明，即使在可逆的PFA设置下，PFA后立即输注钙也会增加钙的吸收，从而导致急性病变比对照组更大。
其次，损伤灶通过钙离子内流的机制也值得注意。Lee等人描述了电穿孔后明显的钙激增导致细胞死亡。我们的组织学评估表明，钙组的急性损伤评分更高，这表明PFA区的钙吸收增加，细胞内钙升高最终导致损伤和细胞凋亡。前期研究提出了钙电穿孔的三种机制：细胞内钙急剧升高和持续升高导致细胞毒性、ATP耗竭影响钙离子破裂、钙水平升高会激活蛋白酶和磷脂酶，从而影响膜修复过程。此外，先前的研究报告表明，在电穿孔诱导致死之前，离体大鼠心肌细胞内Ca2+会迅速大量增加。这些机制很可能是观察到钙质组和对照组病变大小不同的原因。
4 临床影响
PFA参数与消融效果之间的平衡是一种权衡：较高输出的PFA虽然能有效形成较大的病灶，但也有可能产生不良副作用。输出较低PFA可能会导致病灶损伤不持久。这项研究的优势在于利用钙电穿孔技术在较低的PFA设置下增强损伤，从而有可能减轻与PFA治疗相关的副作用风险。钙电穿孔可降低细胞死亡所需的电场阈值。这种方法能以较少的消融量达到预期的消融效果，是一种更安全的替代方法。
5 局限性
研究结果虽然很有希望，但也有一定的局限性。首先，病变评估仅限于PFA术后的急性期。病变特征的这些差异在慢性期是否会持续仍有待确定，这就凸显了纵向研究的必要性。不过，之前的研究表明，PFA后的急性变化可预测慢性变化。我们在本研究中使用的双向、短脉宽方案往往具有较高的致死电场。此外，虽然PFA和钙离子电穿孔都会导致细胞凋亡，病理和组织学结果也表明了这一点，但我们并未对细胞凋亡进行分子染色，如使用caspase-3进行染色。
此外，这是一项初步的概念验证研究。要转化为临床研究，需要优化钙的剂量和PFA的设置，这将取决于使用的导管。此外，没有对钙输注的长期副作用进行广泛研究；需要对潜在的副作用进行跟踪。
最后，我们的研究仅限于输注0.2g钙。虽然钙浓度与病变大小之间的剂量反应关系是可信的，但进一步的研究对阐明这种相关关系至关重要。我们使用较高剂量的钙作为概念验证，以观察效果并克服扩散效应。今后，可以对钙的滴定进行优化，使用较低的浓度，并利用不同的给药方法达到较高的局部浓度，还可以使用single-shot PFA导管，这样需要灌注钙的次数会减少，因为较少的消融次数。
6 结论
与对照组相比，在PFA之后注射钙剂（一种称为钙电穿孔的方法）可在急性期产生更有效的病变。这种辅助治疗方法可以使用较低的PFA参数，从而最大限度地减少与更大范围消融相关的副作用。
如需获取原文，关注公众号回复“氯化钙”即可获取
